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クロントロ塩酸塩（赤身精）検出キット
本キットは競争酵素標準免疫法を用いて尿、筋肉、肝臓及び飼料中のクロントロ及びその他のβドーピングを定量的に測定した。キットには、標準試験およびすべての検査用試薬を含む96個の試験孔が含まれている。定量分析を行う場合は、微孔板酵素スケールが必要です。概要クレントロール（clenbuterol，CLE）
製品の詳細
本キットは競争酵素標準免疫法を用いて尿、筋肉、肝臓及び飼料中のクロントロ及びその他のβドーピングを定量的に測定した。キットには、標準試験およびすべての検査用試薬を含む96個の試験孔が含まれている。定量分析を行う場合は、微孔板酵素スケールが必要です。
サマリー
クロントロ（clenbuterol、CLE）は副腎受容体作動薬である神経ドーピング剤であり、臨床上で気管支喘息、慢性気管支炎と肺気腫などの疾病の治療に用いられるため、薬は赤身率を高め、脂肪沈着を減少させ、動物の成長を促進することができ、一部の畜産養殖企業に養殖促進剤として不法に使用されている。その残留量は人体の筋肉震動、動悸、神経過敏、頭痛、目眩、吐き気、嘔吐、発熱、戦慄などの症状を招き、消費者の健康に極めて危害を及ぼすことができる。現在では養殖業への使用は明示的に禁止されている。HPLCまたはGC-MSは、βドーピングを検出する方法として使用されてきたが、前処理ステップの費用がかかる。酵素結合免疫検査キットは、尿、筋肉、肝臓及び飼料中のCLEを経済的、迅速に検査することができる。
そくていげんり
測定の基礎は抗原抗体反応である。微多孔質プレートにはCLEに対するウサギ抗体が包含されている。洗浄工程を経た後、CLE酵素マーカー、標準または試料溶液を添加した。CLEはCLE−酵素マーカーと競合し、結合していないCLE−酵素マーカーは洗浄工程で除去される。酵素反応基質（過酸化尿素）と発色剤（テトラメチルビフェニルアミン）を孔に添加し、インキュベートした。結合した酵素マーカーは、無色の発色剤を青色の生成物に変換する。反応停止液を加えた後、色を青から黄色に変えた。450 nmで測定したところ、吸収光強度はサンプル中のCLE濃度に反比例した。
提供された試薬（2〜8℃で保存）は決して冷凍しない
各カートリッジ内の試薬は、標準分析穴を含む96個の測定を行うのに十分であり、カートリッジ内の材料は以下の通りである：
1×96ウェルプレート（12条×8ウェル）にウサギIgG抗体を被覆した
6×標準液、(2 ml)はそれぞれ0を含む、0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1 ppbのCLE水溶液
1×CLEペルオキシダーゼ標識濃縮溶液
1×酵素反応基質（6 ml）、過酸化尿素含有
1×発色剤（6 ml）、テトラメチルビフェニルアミン
1×反応停止液（7 ml）、1 M硫酸
1×PBS (10ml), CLE-ペルオキシダーゼマーカー濃縮溶液の希釈に使用
1×PBST濃縮液（40 ml）、800 ml蒸留水で希釈し、プレート洗浄用
サンプル処理
サンプル処理方法1
組織、肉質（純精肉）、内臓サンプルの処理方法：
1.2グラムの均質化されたサンプルを2 mLの溶液1（無色無味）に加え、サンプルを攪拌または振動させ、均一に混合させる。
2.6 ml溶液2（淡黄色、刺激臭がある）を添加し、清潔な箸または竹串でサンプルを5分間攪拌することを推薦する、または溶液中に均一に分布するように15分間振動させる。
3.3000 gを10分間遠心分離した。
4.きれいな平皿に3 mlの上澄み液を取り、60℃の恒温箱で蒸す（30分程度）、試験管中で直接水浴で加熱蒸発乾燥することもできる。
5.残留物を1 ml溶液2（無色無味）で洗浄溶解した。
6.3000 gを10分間遠心分離した。
7.透明な中間部分50 ulを取って直接にサンプリングし、ELISAによる分析。
注：誤って溶液を肌につけた場合は、直ちに75%の医療用アルコール綿で拭き取り、清水で洗い流してください。決して飲んだり、目に飛び込んだりしないでください。
サンプル処理方法2（より迅速）
1、2グラムの均質にしたサンプルを2 mLの溶液1（無色無味）に加え、サンプルを攪拌または振動させ、均一に混合させる。
2、4 mL溶液2（淡黄色、刺激臭あり）を添加し、強く振動し、肉質約2分、組織約6分。
3、3000 gを5分間遠心分離した。
4、上澄み液1 mlをきれいな平皿に取り、70℃~ 80℃の恒温箱で蒸す（約5分程度かかる）。電気で風を当てるか、3分しかかかりません。
5、残留物を0.5 ml溶液3（無色無臭）で洗浄し、底部の白い残留物をすべて溶液に洗浄した。
6、溶離液50 ulを検査用に採取する。
酵素標的免疫解析プログラム
1.測定前の注意
a）使用前にすべての試薬を室温20〜25℃に戻す
b）使用直後にすべての試薬を2〜8℃に戻す
c）使用中は微孔を乾燥させない
d）ELA分析における繰り返し性は、洗濯板の一致性に大きく依存し、推奨洗濯板の順番に丁寧に操作することがELA測定プログラムにおけるポイントである
e）すべての恒温培養中に、光の照射を避け、蓋で微孔板を覆う
2.酵素マーカーと微孔スラット
a）CLE−酵素マーカーが提供するCLE−酵素マーカーは濃縮液である。希釈された酵素マーカーは安定性が悪いため、実際に必要な量の酵素マーカーを1：14希釈するだけである（1μlの酵素マーカーに14μlのPBSを加える）。濃縮液を吸引する前に、丁寧に振盪し、残りは2〜8℃放置して保存する。
b）微孔板条は必要な数量の微孔板及びフレームを取り出し、使わない微孔板をテープで密封し、元の袋に入れて再密封し、4℃或いは-20℃で保存し、湿気に注意する。
3.標準液が提供するCLE標準液濃度は0であり、0.1, 0.3, 0.9, 2.7, 8.1ppb(ng/ml)
4.測定手順（室温25℃で操作）
a)
アルミニウム箔袋を切り取り、十分な基準とサンプルに使用された数の細孔条を微細孔棚に挿入し、基準とサンプルを2つの平行実験を行い、基準とサンプルの位置を記録した。20μlの標準液または処理したサンプルをそれぞれの微孔に添加した。微孔スラットを一度実験しても使いきれない場合は、元のアルミニウム箔袋に戻して密封し、プラスチックをもう一つセットして密封袋を挟んだ後、4℃または-20℃で保存したほうがよく、湿気を避けてください。
b）100μl希釈酵素マーカーを微孔底部に添加し、25℃で30分間インキュベートする（恒温箱の使用を推奨する）。
c）孔の中の液体を注ぎ出し、微孔棚を吸水紙に逆さにして（各行3回たたき）、孔の中の液体を完全に除去することを保証し、250μl
PBSTは孔に充填し、再び微孔中の液体を捨て、2回繰り返し操作した。プレートを洗うたびに洗浄液を加えてから2分待ってから捨てなければならない。スラット間のインキュベーション時間の不一致によるOD値の差を回避するために、洗浄ボトル洗浄プレートを使用することを推奨します。
d）反応基質と発色剤を1：1で混合した後、100μlを微孔に添加し、十分に混合し、25℃で15分間暗所でインキュベートした。
e）50μlの反応停止液を微孔に添加し、混合して450 nmで吸光度値を測定し、停止液添加後10分以内に光度値を読み取らなければならない。
結果＃ケッカ＃
得られた基準とサンプル吸光度値の平均値を最初の基準（0基準）の吸光度値で割って100を掛けたので、0基準は100%に等しく、吸光度値はパーセンテージとして与えられた。
標準的な吸光度値（またはサンプル）
------------------------------×100=%吸光度値
0標準吸光度値
計算された標準値はCLE濃度（ng/g、またはng/ml）に対応する半対数座標系曲線図として描かれ、補正曲線は0.2-2 ng/g（ppb）の範囲内で線形になるべきである。各サンプルに対応する濃度（ng/g、またはng/ml）は、補正曲線から読み出すことができる。
かんど
クロントロアッセイキットの平均検出下限は約0.1 ng/g（0.1 ppb）であった。
特異性
クロントロ類似体との交差反応：
クロントロ（Clenbuterol）100%
ブロモブトロ（brombuterol）110%
セブトロ（cimbuterol）40%
マジェトロ（mapenterol）17%
マブトロ（mabuterol）16%
サルブチルアミンアルコール（salbutamol）9%
トブトロール（tulobuterol）
2%
テブタリン（terbutalin）2%
レクドーパミン<1%
イソプロピレンアドレナリン（Isoproterenol）<1%
アドレナリン（Adrenalin）<1%
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